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En este proyecto se propone estudiar comparativamente (en relación a secuencia, estructura y conformación) enzimas lipolíticas de tipo PLA2 para identificar los dominios de reconocimiento interfacial que inducen alta estabilidad en las interacciones lípido-proteína de sistemas organizados y que están implicados en la modulación fina a nivel de interface lípido-proteína en la catálisis. Se pretende estudiar la influencia de diferentes dominios en su capacidad de hidrolizar y reconocer interfaces lipídicas con diferente estado de empaquetamiento, tipo de fase y tipo de lípido (concepto de calidad interfacial).
Se pretende establecer una relación molecular racional entre la estabilidad dimensional de mezclas lípido/péptido con la conformación, estructura, tipo anfipaticidad en la secuencia peptídica. Se pretende conocer la diferencia que establecen anfipaticidad periódicas de las no-periódicas, estableciendo el mínimo de hidrofobicidad para conformar una interface estable y cuáles son los parámetros moleculares individuales, de superficie, conformacionales y de conjunto que determinan la miscibilidad con lípidos de membrana. Se intentará, una vez establecido la estructura mínima anfipática de un péptido para producir una interface monomolecular estable, realizar un escala de propensidad de los diferentes aminoácidos para la estabilidad lateral. Por otro lado, se intenta establecer una correlación entre las propiedades de superficie de péptidos anfipáticos que contienen aminoácidos que quiebran la estructura α-hélice (prolina) con su capacidad lítica. Se intenta establecer la racionalidad estructural en el ensamble multimolecular que lleva a un péptido comportarse como un formador de poros en membranas organizadas, como un disolvente de la misma, inducir curvaturas o tener propiedades que mimetice con los lípidos sin inducir lisis en una bicapa.
Subproyecto 1: Estudio de la estabilidad térmica de proteínas. Efectos de la interacción proteína-proteína y lípido-proteína.
Objetivo General
Establecer si las interacciones que tienen lugar en los procesos de homodimerización o la interacción con interfases lipídica inducen cambios en la estabilidad térmica de proteínas y si éstos corresponden con cambios conformacionales (estructura secundaria) o en el grado de empaquetamiento de las mismas (estructura terciaria). Establecer una correlación entre grado y
Subproyecto 2: Estudio de la relación estructura-función del sitio de reconocimiento interfacial de fosfolipasas A2 de veneno de Bothrops diporus (Yarará chica) y de soya (Glycine max) y su relación con las propiedades de interacción con interfaces lipídicas.
Objetivos específicos
- Identificar la secuencia primaria a partir de clonado y secuenciamiento de cADN de las diferentes isoespecies de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) de Bothrops diporus (Yarará Chica) y de soya (Glycine max) y optimizar un sistema de expresión con productos con actividad enzimática que permitan realizar los estudios biofísicos y bioquímicos.
- Identificar los dominios catalíticos y de reconocimiento interfacial. Estudio comparativo con fosfolipasas secretorias de la familia utilizando técnicas bioinformáticas. Análisis de isoformas y posibles diferencias funcionales derivadas de las diferencias en la secuencia/conformación.
- Realizar estudios cinéticos de las diferentes isoespecies de PLA2 que tengan modificado el sitio de reconocimiento interfacial para el estudio a nivel molecular de la modulación de la actividad por la “calidad interfacial” de los lípidos en sistemas organizados (monocapas y bicapas).
- Identificar regiones, dominios o aminoácidos involucrados en la especificad de ácido grasos y/o grupo polar de diacilglicerofosfolípidos mediante deleción o mutaciones especificas.
Subproyecto 3. Interacción de péptidos anfipáticos naturales y sintéticos con biointerfases.
Objetivos Específicos
- Correlacionar el tipo hidrofobicidad específica de péptidos sintéticos y la estabilidad bidimensional que estos adquieren en interfaces monomoleculares agua/aire. Establecer una correlación para la influencia de aminoácidos que quiebran la estructura α-hélice (como prolina) en la actividad lítica de péptidos anfipáticos con las propiedades du superficie.
- Correlacionar el tipo de conformación interfacial y su capacidad de interacción con lípidos. Establecer diferencias en el comportamiento de superficie con péptidos anfipáticos no periódicos invertidos (hidrofobicidad acumulada en el N- o C-terminal).
- Evaluar la influencia de colesterol en los parámetros de superficie de mezclas ternarias péptido/fosfolípidos. Establecer la influencia de péptidos de similar anfipaticidad pero con cargas opuestas en la estabilidad con lípidos en mezclas ternarias.
- Correlacionar el tipo de comportamiento en interfaces agua/aire de sistemas mezcla péptidos/lípidos con la capacidad de inducir lisis en sistemas modelos de membranas (LUVs y GUVs).
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Estudio de las propiedades estructurales y dinámicas de agregados amiloides y su implicancia en la estabilidad de biomembranas y degeneración axonal
Dra. Soledad Celej |
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Numerosas condiciones patológicas surgen del plegamiento incorrecto y la acumulación de péptidos o proteínas en estructuras amiloides, agregados altamente organizados ricos en estructura hoja-. Muchas de estas condiciones son neurodegenerativas con gran impacto socio-económico, como la encefalopatía espongiforme y las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. La capacidad de polipéptidos de adoptar el estado canónico fibrilar es una propiedad genérica de la cadena peptídica. Propiedades fisicoquímicas intrínsecas influencian marcadamente la propensidad de polipéptidos de auto-ensamblarse tanto en fibras como en las especies oligoméricas prefibrilares, las cuales se postulan como las especies patogénicas. Numerosas evidencias sugieren que existen características comunes en los mecanismos por el cual agregados prefibrilares formados por diversos polipéptidos contribuyen a la patogenisidad en las amiloidosis. La línea de trabajo está orientada al estudio de los parámetros moleculares, cinéticos y de entorno que conllevan al plegamiento incorrecto, auto-agregación y formación de estructuras amiloideas en proteínas. Actualmente abordamos el estudio a nivel molecular de oligomeros de -synucleina, proteína central en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y otras condiciones neurodegenerativas relacionadas, a fin de contribuir a la comprensión de la relación estructura-toxicidad de especies oligoméricas amiloidogénicas,. En particular, nos enfocamos en el estudio de la estructura y organización supramolecular de especies prefibrilares solubles, el equilibrio dinámico que rige entre las mismas y el impacto que tienen dichas especies en la integridad de biomembranas y degeneración axonal.
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Biofísica de procesos biológicos asociados a la interacción proteína/membranas lipídicas: estudio sistemático de la interacción con interfases de péptidos sintéticos anfipáticos y proteínas asociadas a membranas biológicas
Dr. Ernesto Ambroggio |
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En una célula, el transporte y reciclado de componentes de membranas y organelas se debe a la interacción específica entre proteínas y lípidos donde las membranas u organelas presentan una estructura y composición característica. Cuáles son los parámetros físicos que controlan esta interacción membrana/proteína y cómo la estructura de organelas se mantiene/genera a raíz de dicha relación son preguntas fundamentales tanto en el área de la biofísica como en la de la biología celular. El objetivo general dentro de mi línea de investigación es comprender las propiedades fisicoquímicas de la interacción proteínas/membranas biológicas analizando cómo la variabilidad en la química de proteínas y/o péptidos (estructura primaria) y en las propiedades físicas de modelos de membrana lipídicas (estado de fase, curvatura, tensión de membrana) modulan dicha interacción. A partir de estos estudios biofísicos, experimentales y teóricos, se buscará comprender cómo distintas propiedades fisicoquímicas del sistema proteína/membrana influyen o determinan la organización y funcionamiento de diferentes organelas/procesos celulares. Específicamente se busca establecer la relación entre hidrofobicidad/anfipaticidad y tipo de estructura secundaria de péptidos sintéticos con su estabilidad en interfases agua/aire y modo de interacción de los mismos con lipídos. Estos parámetros se obtendrán mediante el empleo de capas monomoleculares (agua/aire) de Langmuir. Se pretende se estudiar cómo es la interacción de diferentes péptidos y proteínas con bicapas lipídicas cuando las propiedades químicas de las proteínas cambian como así también las características físicas de la membrana de lípidos. Existen distintos sistemas donde es posible generar liposomas unilamelares (interfase compuesta por una sola bicapa lipídica) y controlar las propiedades fisicoquímicas de membrana como, por ejemplo, la composición lipídica (distinto tipo de grupos polares o cadenas acilo en los lípidos), curvatura (liposomas de distinto tamaño o mediante la generación de nano-tubos lipídicos) y tensión de membrana. Específicamente, analizará cómo diferentes tipos de anfipaticidad/hidrofobicidad peptídica promueven distintas formas de interacción con bicapas y cómo, a raíz de esta interacción, se puede alterar la estabilidad de membranas y/o conformación de la bicapa (por ejemplo cambios en el orden y/o curvatura). Por otro lado, se pretende saber cómo es controlada la interacción con la membrana para un dado tipo de proteína cuando existen cambios en la composición de la bicapa y en las propiedades físicas de la misma (curvatura, tensión superficial) influyendo estas últimas en la capacidad de unión a la membrana y/o actividad de la proteína. Mediante la expresión en células de construcciones de proteínas de membrana con diferente anfipaticidad/hidrofobicidad en la región que interacciona con la membrana, se buscará comprender cómo ello influye tanto, en la localización y distribución subcelular de las proteínas, como en la estructura de la membrana de la organela involucrada. Dentro de este esquema, también se alterarán distintas vías de transporte y metabólicas en células en cultivo para seguir los posibles cambios estructurales o composicionales en la membrana y cómo estos pueden afectar la distribución de las proteínas de interés. Principalmente se utilizarán diferentes técnicas de microscopía ya sea de fluorescencia (confocal), de fluorescencia con resolución nanométrica (PALM), electrónica y de fuerza atómica.
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Integrantes actuales del laboratorio; estudiantes de la carrera de Doctorado de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC |
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Lic. en Química Pablo Yunes Quartino.
Tema: Estudio de la secuencia y estructura de fosfolipasas A2 de Bothrops neuwiedii (yarará chica) y su relación con las propiedades de superficie y cinéticas.
Beca de CONICET desde 2008.
Director: Dr. Gerardo Fidelio |
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Lic. en Bioquímica Elisa Mariani.
Tema:
El reconocimiento interfacial y las propiedades catalíticas de fosfolipasa A2 de soja (glycine max) en la bioconversión de fosfolípidos.
Beca de CONICET-MCyT CBA desde 2009. Co-director: Dr. Gerardo Fidelio
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| Investigadores formados en este laboratorio, Tesis Doctorales dirigidas por el Dr. Gerardo Fidelio y entregadas por la Facultad de Ciencias Químicas, UNC.
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Autora: Lic. Soledad Celej
Tema: Estudio de la estabilidad térmica de proteínas inducida por ligandos e interfases. Caracterización de subestados conformacionales en proteínas.
Año: 1999 |
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Lic. Ernesto Ambroggio
Tema: Interaccion de péptidos sintéticos de determinada polaridad con interfases
Director: Dr. Gerardo D. Fidelio.
Año de Inicio: 2002 |
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Publicaciones seleccionadas del laboratorio
Dr. Gerardo Fidelio |
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Protein unfolding coupled to ligand binding. Differential scanning calorimetry simulation approach. Celej, M.S., Dassie , S.A. and Fidelio, G.D. J. Of Chemical Education. 2005, 82, 85-92.
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Surface Behavior and Lipid Interaction of Alzheimer {beta}-Amyloid Peptide 1-42: a Membrane-disrupting Peptide. Ambroggio EE, Kim DH, Separovic F, Barrow CJ, Barnham KJ, Bagatolli LA. and Fidelio GD. Biophys J. 2005: 88, 2706-2713.
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Ligand-Indiced thermostability in proteins: thermodynamics análisis os ANS-albumin interaction. MS, Dassie SA, Freire E, Bianconi ML and Fidelio GD. Biochem. Biophys. Acta. 2005: 1750, 122-133.
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Direct visualization of the lytic action of antibiotic peptides. Ambroggio E.E., Separovic F., Bowie J.H., Fidelio G.D. and Bagatolli L.A. 2005. Biophys J. 2005, 89: 1874-1881.
- Amyloid-beta peptide disruption of lipid membranes and the effect of metal ions. LAU TL, AMBROGGIO EE, TEW DJ, CAPPAI R, MASTERS CL, FIDELIO GD, BARNHAM KJ, AND SEPAROVIC F.J 2006 J. Mol Biol. 356: 759-70
- Differential scanning calorimetry as a tool to estimate binding parameters in multiligand binding proteins. CELEJ MS, DASSIE SA, GONZALEZ M, BIANCONI ML, AND FIDELIO GD. Anal Biochem. 2006, 350: 277-284.
- Interfacial properties of the M1 segment of the nicotinic acetylcholine receptor. AMBROGGIO EE, VILLARREAL MA, MONTICH GG, RIJKERS DT, DE PLANQUE MR, SEPAROVIC F, FIDELIO GD. Biophys Chem. 2006 Jun 1;121(3):171-6
- Biophysical properties of a synthetic transit peptide from wheat chroloplast ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase. AMBROGGIO EE, AUSTEN B. AND FIDELIO GD. 2007. J. Pep. Sci. 13: 245-252.
- A novel theoretical tool for the analysis of calorimetric data of oligomeric proteins. BURGOS, I; DASSIE, S.A.; FIDELIO, G.D. 2008. J. Phys Chem. B. (2008) 112(45):14325-14333.
- Binding of the highly toxic tetracycline derivative, anhydrotetracycline, to bovine serum albumin. BURGOS M.I., FERNANDEZ, R.A., CELEJ, M.S. ROSSI, L.I., FIDELIO, G.D. AND DASSIE, S.D. Biol. Pharm. Bull.. (2011), 34(8), 1301-1306.
- Thermodynamic and structural analysis of homodimeric proteins: model of β−lactoglobulin. 2011. BURGOS, I., DASSIE, S., VILLARREAL, M, and FIDELIO, G.D. Manuscript ID: BBAPRO-11-209. Submitted to BBA
- Identification, Sequence, Phylogenetic analysis and Molecular Dynamics Simulation of a new Secretory Phospholipase A2 from Glycine max Soybean. MARIANI, M.E., VILLARREAL, M.A., LEIVA, E.P.M., MADOERY, R.R. AND FIDELIO, G.D. Submitted to Proteins.
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Publicaciones seleccionadas del laboratorio
Dra. Soledad Celej |
- 1. Small molecule fluorescent probes for the detection of amyloid self-assembly in vitro and in vivo. Bertoncini CW, Celej MS (co-responsables). Review por invitación. Current Protein and Peptide Science (2011) 12:205-220.
- 2. Binding of the highly toxic tetracycline derivative, anhydrotetracycline, to bovine serum albumin. Burgos I, Fernandez A, Celej MS, Rossi L, Fidelio G, Dassie S. Biol. Pharm. Bull. (2011) 34:1301-1306.
- 3. Characterization of coupled ground state and excited state equilibria by fluorescence spectral deconvolution. Caarls W, Celej MS, Demchenko A, Jovin TM. J. Fluorescence (2010) 20:181-190.
- 4. A triple emission fluorescent probe reveals distinctive amyloid fibrillar polymorphism of wild-type α-synuclein and its familial Parkinson’s disease-mutants. Celej MS, Caarls W, Demchenko AP A, Jovin TM. Biochemistry (2009), 48: 7465-7472
- 5. Solid-state NMR reveals structural differences between wild-type and disease-related A53T mutan fibrils of -synuclein. Heise H, Celej MS, Becker S, Riedel D, Pelah A, Kumar A, Jovin TM, Baldus M. J. Mol. Biol. (2008) 380:444-450.
- 6. Fluorescent N-arylaminonaphthalene sulfonate probes for amyloid aggregation of -synuclein. Celej MS, Jares-Erijman EA, Jovin TM. Biophys. J. (2008) 94:4867-4879.
- 7. Differential scanning calorimetry as a tool to estimate binding parameters in multi-ligand binding proteins. Celej MS (responsable), Dassie SA, González M, Bianconi ML, Fidelio GD. Anal. Biochem. (2006) 350: 277-284.
- 8. Ligand induced thermostability in proteins: thermodynamic analysis of ANS-albumin interaction. Celej MS, Dassie SA, Freire E, Bianconi ML, Fidelio GD. Biochem. Biophys. Acta (2005) 1750: 122-133.
- 9. Protein unfolding coupled to ligand binding. Differential scanning calorimetry simulation approach. Celej MS, Dassie SA, Fidelio GD. J. Chem. Educ. (2005) 82: 85-92.
- 10. Conformational flexibility of avidin: the influence of biotin binding. Celej MS, Montich GG, Fidelio GD. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) 325: 922-927.
- 11. Superactivity and conformational changes on alpha-chymotrypsin upon interfacial binding to cationic micelles. Celej MS, D´Andrea MG, Campana PT, Fidelio GD, Bianconi ML. Biochem. J. (2004) 378: 1059-1066.
- 12. Protein stability induced by ligand binding correlates with changes in protein flexibility. Celej MS, Montich GG, Fidelio, GD. Protein Sci. (2003) 12: 1496-1506.
- 13. Amperometric Glucose Biosensor Based on Gold-Dispersed Carbon Paste. Celej MS, Rivas G. Electroanalysis (1998) 10: 771-775.
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Publicaciones seleccionadas del laboratorio
Dr. Ernesto Ambroggio |
- -ArfGAP1 generates an Arf1 gradient on continuous lipid membranes displaying flat and curved regions. Ambroggio E, Sorre B, Bassereau P, Goud B, Manneville JB, Antonny B. EMBO J. 2010 Jan 20;29(2):292-303 -
- Biophysical properties of a synthetic transit peptide from wheat chloroplast ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase. Ambroggio EE, Austen B, Fidelio GD. J Pept Sci. 2007 Apr;13(4):245-52.
- Interfacial properties of the M1 segment of the nicotinic acetylcholine receptor. Ambroggio EE, Villarreal MA, Montich GG, Rijkers DT, De Planque MR, Separovic F, Fidelio GD. Biophys Chem. 2006 Jun 1;121(3):171-6. -
- Direct visualization of membrane leakage induced by the antibiotic peptides: maculatin, citropin, and aurein. Ambroggio EE, Separovic F, Bowie JH, Fidelio GD, Bagatolli LA. Biophys J. 2005 Sep;89(3):1874-81.
- Surface behavior and lipid interaction of Alzheimer beta-amyloid peptide 1-42: a membrane-disrupting peptide. Ambroggio EE, Kim DH, Separovic F, Barrow CJ, Barnham KJ, Bagatolli LA, Fidelio GD. Biophys J. 2005 Apr;88(4):2706-13.
- Surface behaviour and peptide-lipid interactions of the antibiotic peptides, Maculatin and Citropin. Ambroggio EE, Separovic F, Bowie J, Fidelio GD. Biochim Biophys Acta. 2004 Jul 1;1664(1):31-7.
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